Ansökan: Funktionella och Strukturella Studier av Ribosomskafter och GTPaser i Proteinsyntes

Tidsperiod:

1 januari 2015 – 31 december 2018

Projektledare:

Suparna Sanyal

Finansiär:

Vetenskapsrådet

Bidragstyp:

Projektbidrag

Budget:

3 350 000 SEK

Ribosomer är cellens proteinfabriker och översätter (translaterar) den genetiska koden från mRNA till proteiner. De består av en stor och en liten enhet som båda är uppbyggda av RNA och många olika proteiner. Förutom ribosomer, används ett stort antal proteiner i translationen som kallas translationsfaktorer. Några av dessa är initieringsfaktor 2 (IF2) som behövs för initiering, elongeringsfaktorerna Tu (EF-Tu) och G (EF-G) som fogar nya aminosyror till det växande proteinet och frisättningsfaktor 3 (RF3) som behövs för att avsluta proteinsyntesen. Alla dessa proteiner är s.k. G-proteiner eller GTPaser, d.v.s. proteiner som spjälkar GTP (guanin trifosfat) för att frigöra energi som behövs för att utföra den process proteinet i fråga styr. De nämnda G-proteinernas GTPas-aktivitet, stimuleras när de binder till ribosomen under proteinsyntesen. Nästan alla translationsfaktorer, inklusiv IF2, EF-Tu, EF-G och RF3 binder till ungefär samma yta på ribosomens stora enhet, en del som ser ut som ett utskott och därför kallas ribosomens ?stjälk? eller ?skaft?. Ribosoms L12 skaftet består av fyra eller sex kopior av ett mycket flexibelt protein L12 som binder till protein L10, vilket i sin tur binder till ribosomala RNA. Om L12 tas bort från ribosomen hämmas G-proteinernas GTPas-aktivitet kraftigt och de kan inte längre fungera. Hur hämningen går till i detalj är dock ännu inte klarlagt. Det föreliggande projektet avser att utreda hur L12 proteinerna i ribosomskaftet stimulerar GTPas-aktiviteten hos de G-proteiner som är inblandade i translation processen. Vi kommer att undersöka betydelsen av L12 protein i funktion av GTPaser med hjälp av kinetiska metoder. Vi kommer aven att studera interaktionen mellan L12 och dessa G-proteiner med fluorescensspektroskopi. Med hjälp av mutagenes, vi kommer att kartlägga vilka aminosyror i G-proteinerna binder till L12. Denna studie ska förklara betydelsen av L12 proteiner i funktion av GTPaser. Vi kommer också att undersöka betydelsen av GTP hydrolys i olika stegen av proteinsyntes. Ribosomala stora subenheten besitter också en annan axelstruktur som kallas L1 skaft. Den skaftet består av protein L1 och ribosomala RNA, som rör sig tillsammans. L1 skaftet binder ?transfer-RNA (tRNA)? på ribosomen och kan trigga rörelser i de ribosomala subenheter. Hur dessa rörelser styrs av L1 är oklart och behöver detaljerad undersökning, vilket är ett mål för detta projekt. En viktig teknik som kallas FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kommer att användas för att folja interaktionen mellan L1 och tRNA under proteinsyntesen. Läkare skriver ut ofta recept med antibiotika som medicin för bakteriell infektion. Många av dessa antibitotiker riktar sig till ribosomen och translationsfaktorer. Tyvärr, vet vi inte så mycket om hur antibiotika fungerar och blockerar bakteriell proteinsyntes. Vi har nyligen utvecklat en kinetisk method för studiera antibiotik aktivitet. Med denna metod har vi analyserat mekanismen av fusidinsyras aktivitet. Förhoppningsvis kommer vi att kunna tillämpa denna metod för att förstå andra antibiotiker också, t.ex. viomycin och aktinomycin. De övriga målen med projektet är att undersöka struktur och funktion av nya translationsfaktorer, där mycket lite information finns tillgänglig. Vår studie kan ge värdefull information för att designa effektiva läkemedel mot bakterier. Projektet är tvärvetenskapligt och kommer att utnyttja såväl genetiska, biokemiska och strukturella metoder (till exempel röntgen kristallografi och kryo-elektronmikroskopi). Vissa delar kommer att drivas med ett aktivt samarbete med andra grupper inom eller utanför Sverige. Resultaten från vår forskning kommer dels att publiceras i vetenskapliga tidskrifter för att läsas av andra forskare, men även i populärvetenskapliga tidskrifter för att nå ut till en bredare publik. Resultaten kommer också presenteras vid vetenskapliga konferenser. Denna studie kommer att väsentligt öka förståelsen av proteinsyntesen hos bakterier