Elf labb

Forskning

Utveckling av antibiotikaresistens och hur man förebygger den

Utveckling av antibiotikaresistens är en av våra största globala hälsoutmaningar. Vi strävar efter att förstå mekanismerna bakom resistensutveckling och att utveckla nya verktyg för snabb upptäckt och diagnos.

I konventionell antibiotikaresistenstestning (AST) mäter man bakterietillväxt i närvaro av antibiotika på en odlingsplatta eller i en flytande kultur. Dessa tekniker är robusta men tar upp till flera dagar att utföra eftersom de är beroende av tillväxt på populationsnivå. Genom att använda teknik som utvecklats i vårt laboratorium har vi kunnat minska tiden avsevärt. Vårt verktyg låter oss fånga och observera enskilda bakterier i kontrollerade miljöer och mäta deras tillväxtdynamik i realtid. Det viktigaste konceptuella genombrottet för resistenstestning var möjligheten att mäta den omedelbara effekten av antibiotika på enskilda celler, vilken kan detekteras inom några minuter hos många bakterier.

Vi validerade tekniken i labbet och demonstrerade tillförlitliga resistensavläsningar (Baltekin et al. PNAS 2017). Genom att medelvärdesbilda mätningar över många celler och normalisera mot obehandlade kontroller uppnådde vi robusta resultat trots stor variation mellan cellerna. Eftersom vi insåg den kliniska potentialen grundade vi Astrego Diagnostics 2017 för att omsätta metoden till ett praktiskt system. Genom tekniska framsteg inom nanofluidisk chipdesign, automatiserad avbildning och dataanalys utvecklades konceptet till diagnostikverktyget PA-100. Systemet säljs nu i hela Europa och kan detektera antibiotikakänslighet för urinvägsinfektioner på cirka 30 minuter.

För närvarande utvecklar vi en metod för att utföra sepsis-AST direkt från patientblod (Miguélez et al. npj Digital Medicine 2025) samt verktyg för snabb känslighetstesning av tuberkulos (TB)(Tran et al. Nat. Commun. 2025). Sepsis är en vanlig dödsorsak över hela världen och patienterna försämras snabbt, ofta inom några timmar. En utmaning med snabb AST vid sepsis är att bakteriekoncentrationen i patienternas blod är mycket låg. Vi undersöker därför metoder för att utföra AST vid den ultimata känslighetsnivån: en enda cell. I det här fallet kan vi inte använda medelvärden för att minska brus, och vi måste använda samma cell för behandling och som obehandlad referens.

Läkemedelsresistent tuberkulos är ett stort hot mot människors hälsa och bidrar till antimikrobiell resistens globalt. Bakterierna som orsakar tuberkulos växer långsamt och det är otroligt tidskrävande att testa bakteriernas känslighet för olika antibiotika. Genom att använda en mikrofluidisk lösning för att fånga bakterier och mäta antibiotikasvaret på encellsnivå i realtid kan vi utföra känslighetstestning för tuberkulos på mindre än 24 timmar istället för veckor.

Slutligen har vi utvecklat en metod för att kombinera AST och identifiering av bakterieart på encellsnivå, vilket möjliggör snabb AST av infektioner orsakade av flera olika patogener (Kandavalli et al. Nat. Commun. 2022).

Bakteriecellcykeln och kromosomstrukturen

En central fråga i labbet har länge varit hur bakterieceller koordinerar DNA-replikation och genuttryck för att upprätthålla homeostas samtidigt som de fortsätter att reagera på förändringar i miljön. Genom att kombinera mikrofluidik med högupplöst mikroskopi för att direkt observera tillväxtdynamiken hos enskilda levande bakterier har vi kunnat studera detta problem på molekylnivå. Detta arbete har visat att genuttryck och tillväxt är tätt kopplade på individcellnivå, men fortfarande väldigt brusiga, vilket kräver robusta strategier för koordinering av DNA-replikation och delning (Wallden et al. Cell 2016; Knöppel et al. PNAS 2023).

En annan intressant aspekt är hur bakteriens kromosomstruktur förändras under cellcykeln och vilken roll strukturen spelar för uttrycket av olika gener. Vi använder avancerad mikroskopi och sekvenseringsbaserade metoder för att skapa en högupplöst, dynamisk karta över E. coli-bakteriens kromosomstruktur. Men en sådan karta skulle vi kunna besvara frågor som (1) hur reproducerbar kromosomorganisationen är från cell till cell vid varje punkt i cellcykeln, (2) påverkar genomsekvensen, eller positionen i sekvensen, var ett visst DNA-segment hamnar i den fyrdimensionella strukturen, (3) hur förändras strukturen om man lägger till, tar bort, eller flyttar stora genomsegment, (4) hur påverkar en gens 3D-lokalisering dess uttryck, (5) hur koordinerar cellen som växer de olika kromosomkopiorna samt (6) hur förändras strukturen för att möjliggöra homolog rekombination efter ett specifikt dubbelsträngat brott?

Även om E. coli är en användbar modellorganism behöver vi också undersöka andra arter för att förstå exempelvis patogenicitet och skillnaderna mellan arter. Kromosomstrukturen hos Mycobacterium tuberculosis (M. tb.) spelar en central roll för sjukdomens biologi och potentiellt även för utvecklingen av nya diagnostiska metoder. Omstruktureringen av kromosomen är nära kopplad till bakteriens förmåga att överleva i fientliga miljöer. Vi använder de metoder som vi har utvecklat för E. coli för att studera dessa mekanismer.

Tidigare genombrott

Optisk poolad screening

Vi har utvecklat och implementerat tidiga versioner av den metod som nu kallas optisk poolad screening (OPS). Metoden används för att undersöka dynamiska fenotyper i ett poolat bibliotek av cellstammar. Efter att cellerna har avbildats fixeras de och identifieras genom in situ-genotypning av en DNA-streckkod. Metoden beskrevs först i en patentansökan som offentliggjordes i januari 2016 (Elf et al. 2016). Vår proof-of-principle-publikation (Lawson et al. 2017) beskrev hur man kan karaktärisera molekylära fenotyper i levande celler i ett litet CRISPR-bibliotek. Sedan publicerade vi en större CRISPRi-screening för att bestämma hur olika mutationer påverkar noggrannheten vid replikationsinitiering (Camsund et al. 2020). I samarbete med Mats Nilsson har vi utökat metoden för att kunna arbeta med kromosomalt uttryckta streckkoder (Soares et al. 2025).

Bindningskinetik för enskilda molekyler i levande celler

Tillsammans med Gene-Wei Li och Sunney Xie demonstrerade Johan Elf att det är möjligt att spåra enskilda molekyler i levande celler med hjälp av stroboskopisk belysning (Elf et al. 2007). Vi bestämde också hur lång tid det tar för en transkriptionsfaktor att hitta och binda till sin kromosomala operator. Vi använde senare samma princip (English et al. 2011) för att spåra proteiner som diffunderar fritt i cytoplasman och introducerade en metod för att bestämma bindningstillstånd in vivo baserat på diffusionskonstanter. Artikelns resultat gällande RelA-biologi har ifrågasatts av goda skäl (Elf och Barkefors 2019). År 2013 publicerade vi en metod för att spåra hur enskilda molekyler binder och släpper, och från dessa mätningar bestämma deras associations- och dissociationshastigheter med hjälp av dold Markov-modellanalys (Persson et al. 2013). Sedan dess har vi använt metoden för att karakterisera intracellulär sökkinetik för LacI (Hammar et al. 2012, 2014), Cas9 (Jones et al. 2017) och i homolog rekombination efter en dubbelsträngad brytning (Wiktor et al. 2021). Tillsammans med Stefan Hell utvecklade vi även den optiska metoden MINFLUX (Balzarotti et al. 2017) och utökade den för att möjliggöra snabb enmolekylspårning i 3D (Amselem et al. 2023).

The next subvolume-metoden

The next subvolume-metoden är en algoritm för att simulera stokastisk kemi i tre rumsdimensioner (Elf och Ehrenberg 2004), såsom den beskrivs av reaktionsdiffusionsmasterekvationen. Algoritmen delar in rummet i N voxlar, och tiden för nästa reaktion i varje voxel samplas och ordnas i en datastruktur som stöder snabb sökning. Detta möjliggör reaktionsdiffusionssimuleringar som skalar med log(N) snarare än N i en naiv Gillespie-implementering, vilket gör det praktiskt möjligt att simulera stokastiska 3D-system.

Vi har utvecklat simuleringsprogramvaran (Hattne et al. 2005), korrigerat den masterekvation som gäller när voxelstorleken närmar sig molekylernas reaktionsradie (Fange et al. 2010), och introducerat verktyg för att simulera mikroskopiexperiment (Lindén et al. 2016).

Sökproblemet

Hur kan en DNA-bindande molekyl hitta och identifiera en specifik genetisk sekvens? Denna fråga har varit temat för flera olika projekt i labbet. Vi har kommit fram till att transkriptionsfaktorn lacI, som reglerar laktosnedbrytningsmaskineriet i cellen, söker efter sitt bindningsställe genom att kombinera 3D-diffusion med att glida längs DNA-helixen. Transkriptionsfaktorn glider cirka 45 baser innan den lossnar efter 1 ms, och även om den söker igenom hela genomet tar det bara några minuter att hitta och binda till operatorn (Hammar et al. Science 2012; Hammar et al. Nature Genetics 2014). Vi har också mätt hur LacI scannar DNAt på mikrosekundskalan (Marklund et al. Nature 2020; Marklund et al. Science 2022).

Till skillnad från LacI, som söker igenom DNA-sekvensen via interaktioner med utsidan av dubbelhelixen, måste Cas9 separera de två nukleotidsträngarna för att kunna hitta rätt sekvens. Även om Cas9:s sökproblem underlättas av att potentiella mål definieras av en PAM-sekvens, är det fortfarande en svår uppgift. Vi har funnit att dCas9-molekylen i genomsnitt tillbringar 6 timmar på jakt efter sin målsekvens. Jämfört med söktiden för transkriptionsfaktorer är det en evighet, men det är priset CRISPR/Cas9-systemet måste betala för flexibiliteten att kunna leta efter i princip vilken sekvens som helst (Jones et al. Science 2017).

Vi har också bidragit till att besvara den kniviga frågan om hur en trasig kromosom kan söka efter och hitta sin homologa systerkromosom inom några minuter efter ett dubbelsträngsbrott. Genom att inkorporera de trasiga strängarna i ett styvt, transcellulärt filament minskar cellen sökproblemet från 3D till 2D, vilket påskyndar processen avsevärt (Wiktor et al. Nature 2021).