Experimentella tekniker

Våra experimentella tekniker:

• Kryotransmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM)
• QCM-D
• Andra tekniker

Kryotransmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM)

Amfifila molekyler, såsom lipider, ytaktiva ämnen och sampolymerer, kan via självmontering bilda en mängd komplexa strukturer i utspädd vattenlösning. Dessa känsliga och dynamiska strukturer är ofta mycket känsliga för förändringar i temperatur, koncentration och jonstyrka. Följaktligen kan fixerings-, torknings- och färgningsprotokoll för konventionell elektronmikroskopi inducera allvarliga strukturella artefakter. Kryotransmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM) har utvecklats som ett utmärkt verktyg för att undersöka dessa labila strukturer.

Aggregatstrukturen i mikroskop.

Aggregatstruktur i monoolein/oljesyradispersion.
Cryo-TEM är idealiskt lämpad för visualisering av strukturer i storleksintervallet 5-500 nm och under de senaste 15 åren har vi framgångsrikt använt tekniken för strukturella undersökningar av system som innehåller miceller, liposomer och olika relaterade lipid-/ytaktiva aggregat. Enligt vår erfarenhet erbjuder cryo-TEM-metoden unika möjligheter att hämta detaljerad information på aggregerad nivå och utgör ett värdefullt komplement till mer indirekta metoder, såsom ljusspridning, NMR, SAXS och fotofysiska tekniker.

De fibrillliknande aggregaten i mikroskop.

Fibrillliknande aggregat bildas vid inkubation av Amyloid ß-peptid
med den fleromättade fettsyran dokosahexaensyra (DHA).
Utrustningen på vår mikroskopienhet är: transmissionselektronmikroskop Zeiss LIBRA-120 och miljökammare för provberedning.

QCM-D

Suspensionen av lipider i vatten kan leda till bildandet av flera olika strukturer, såsom liposomer och lipiddubbelskiktsskivor. Dessa kan framställas på ett sätt som efterliknar biologiska cellmembran eller kan utformas för att presentera optimala egenskaper för tillämpningar vid läkemedelsleverans.

Ett sätt att karakterisera dessa strukturer och deras interaktion med andra molekyler (t.ex. peptider, proteiner, ytaktiva ämnen, etc.) är att immobilisera dem på ett avkänningsstöd. I vår forskning använder vi Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D) för detta ändamål. Detta instrument är baserat på de piezoelektriska egenskaperna hos kvarts, d.v.s. förmågan att producera en mekanisk deformation vid applicering av en elektrisk potential på materialet. När en växelströmspotential appliceras över elektroder som är anslutna till en kvartssensorkristall, kommer den senare att svänga. Oscillationsresonansfrekvensen för sensorkristallen kommer bland annat att bero på sensorns totala massa. Därför, vid adsorption av material på sensorytan, kan förändringar i frekvensen observeras och den avsatta massan kan kvantifieras med hög känslighet (inom området nanogram per kvadratcentimeter).

QCM-D kan också ge information om de strukturella egenskaperna hos den avsatta filmen. Detta uppnås genom att bestämma systemets "förlustfaktor". Efter att kristallen har fåtts att oscillera med sin resonansfrekvens stängs AC-potentialen av. Svängningens amplitud kommer då att avta. Om den avsatta filmen är mjuk kommer en del av oscillationsenergin att gå förlorad på grund av deformationen av skiktet och oscillationsfrekvensen kommer att avta snabbare. En mätning av hastigheten för denna avklingning tillhandahåller förlustfaktorn, som sedan kan relateras till det immobiliserade materialets viskositet och elasticitet.

QCM-D-signaler erhållna för bildandet av (vänster) ett immobiliserat mjukt liposomskikt innehållande stora mängder vatten och (höger) ett stelt, understödd lipiddubbelskikt.

När strukturerna är immobiliserade kan vi studera deras interaktion med t.ex. antimikrobiella peptider (AMP). Bindningen av dessa peptider till de immobiliserade lipidstrukturerna ökar den laddade massan på sensorytan, vilket omvandlas till frekvensförändringar. Peptid/lipidmembranassociationsisotermer har erhållits med detta tillvägagångssätt. Det är också möjligt att bestämma om associationen med peptiderna förändrar de strukturella egenskaperna hos det immobiliserade lipidskiktet.

QCM-D E1 finns på vårt laboratorium.

Andra experimentella tekniker

Följande experimentella tekniker och utrustning finns också tillgängliga på vårt laboratorium:

Dynamisk ljusspridning (DLS)

Användbar för att bestämma storleken på partiklar och nanostrukturer i suspension. Vi har en specialbyggd DLS-uppsättning som tillåter, förutom partikelstorlek, studier av ljusspridning i olika vinklar. En Nicomp 380 Zeta Potential/Partikelstorlek finns också. Detta instrument kan, förutom DLS, även utföra z-potentialbestämningsexperiment via Laser Doppler Velocimetri (LDV) och Phase Analysis Light Scattering (PALS).

Differential Scanning Calorimetry (DSC)

En CSC 4100 Multi-cell Differential Scanning Calorimeter används i vårt laboratorium för att studera fasövergångar i självassocierade lipidsystem.

UV/Vis och fluorescensspektroskopi

En SPEX fluorolog 1650 0,2 m dubbelspektrometer finns tillgänglig internt. Experiment på liposompermeabilitet, fluorescensanisotropi, liposom-liposomfusion, etc. kan utföras med detta instrument.

En HP 8453 UV/Vis-spektrometer finns också tillgänglig.

Elektrokemiska metoder

Vi använder en Ivium CompactStat-potentiostat för att utföra elektrokemiska studier med stödda lipiddubbelskikt. Teknikerna som används i vårt laboratorium inkluderar bland annat cyklisk voltammetri, elektrokemisk impedansspektroskopi och kronoamperometri. De elektrokemiska mätningarna kan kopplas till QCM-D-bestämningar genom att använda elektrokemimodulen från Q-Sense.

Liposomberedning

Vi har utrustning för att förbereda liposomer och andra självmonterade strukturer med olika metoder, inklusive extrudering, sonikering och tvättmedelsutarmning.